ATCC細胞庫90029

簡要描述：在實際操作中，凍存細胞要進行復蘇，再培養傳代。復蘇細胞一般采用快速融化法。以保證細胞外結晶快速融化，以避免慢速融化水分滲入細胞內，再次形成胞內結晶損傷細胞。

更新時間：2022-07-19

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細胞名稱：ATCC細胞庫90029

ATCC細胞的原代培養、傳代培養、凍存和復蘇實驗方法步驟

一、ATCC細胞 細胞凍存方法

主要操作步驟為：

(1)選擇處于對數生長期的細胞，在凍存前一天*換液。將多個培養瓶中的細胞培養液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。適時去掉胰蛋白酶，加入少量新培養液。用吸管吸取培養液反復吹打瓶壁上的細胞，使其成為均勻分散的細胞懸液。懸浮生產細胞則不要消化處理。然后將細胞收集于離心管中離心(1000r/min，10分鐘)。

(2)去上清液，加入含20%小牛血清的*培養基，于4℃預冷15分鐘后，逐滴加入已無菌的DMSO或甘油，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，細胞濃度為3×106～1×107/mL之間。

(3)將上述細胞分裝于安瓿或冷凍塑料管中，安瓿裝1～1.5mL在火焰噴燈上封口，封口處要*封閉，圓滑無勾。冷凍管要將蓋子蓋緊，并標記好細胞名稱和凍存日期，同時作好登記(日期、細胞種類及代次、凍存支數)。

(4)將裝好細胞的安瓿或凍存管裝入沙布袋內;置于液氮容器頸口處存放過夜，次日轉入液氮中。采用控制降溫速度的方法也可采用下列步驟：先將安瓿置入4℃冰箱中2～3小時，再移至冰箱冷凍室內3～4小時(此步可省略)，再吊入液氮容器頸氣態部分存放2小時，蕞后沉入液氮中。

細胞凍存在液氮中可以長期保存，但為妥善起見，凍存半年后，*取出一只安瓿細胞復蘇培養，觀察生長情況，然后再繼續凍存。

ATCC細胞庫90029

二、細胞的復蘇

一、細胞復蘇的原則

在實際操作中，凍存細胞要進行復蘇，再培養傳代。復蘇細胞一般采用快速融化法。以保證細胞外結晶快速融化，以避免慢速融化水分滲入細胞內，再次形成胞內結晶損傷細胞。

二、細胞復蘇的主要操作步驟

(1)佩戴眼鏡和手套，從液氮罐中取出安瓿或冷凍管。

(2)迅速放入38℃水浴中，并不時搖動，在1分鐘內使其*融化，然后在無菌下取出細胞。

(3)在1000r/min速度下離心5～10分鐘，棄去上層液，加入適量培養液后接種于培養瓶中，接種濃度1×109/L，置37℃溫箱靜置培養，次日更換一次培養液，繼續培養，觀察生長情況。

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選擇上海青旗生物細胞有3個理由：

1、細胞狀態好，形態佳，易成活，是市面上比較好養的細胞之一;

2、物流迅速，復蘇好后發貨，次日就能到;

3、使用我司推薦的進口品牌血清進行培養實驗，效果更佳。

細胞培養小技巧：

1. 買細胞要去靠譜的地方買，比如 ATCC 或者青旗生物。一般上面會有針對細胞的介紹，這樣培養之前可以了解細胞正常生長的狀態圖、傳代、培養基的類型等。

2. 不管是買的細胞，還是別人惠贈的細胞，剛拿到手趕緊的做兩件事：檢測是否有支原體污染;迅速擴增凍存，凍存細胞復蘇后第二天*更換一次培養基。

3. 發現細胞有污染迅速處理掉，特別是當你養了很多種細胞時。細菌污染、真菌污染很容易發現，支原體污染的話，細胞會長的慢，可以買個支原體檢測的試劑盒定期檢測一下。

4. 不同細胞生長周期不同。有的生長很快，比如說 MDA-MB-231，傳代的時候取離心懸液的十分之一就已經足夠了。有的又是特別慢，比如 BT474，傳代是一分二，復蘇起始的時候兩周多才能長滿。這就需要要在培養細胞的過程中多多摸索。

5. 對于嬌弱的細胞，就得細心呵護。胰酶消化不能過久，吹得時候要輕柔，離心時候也要注意轉速和時間。每天都要去看一下細胞，肉眼觀察培養基狀況、顯微鏡下觀察細胞生長狀況。記住，是每天。